BAB
I
PENDAHULUAN
A. Latar
belakang
Bakteri adalah domain yang
terdiri dari makhluk hidup yang tidak memiliki membran inti (prokariota).
Bakteri memiliki beragam variasi bentuk,seperti coccus, basil, dan spiral,
serta dapat hidup soliter maupun berkoloni.Habitat bakteri sangat bervariasi,
dari air, tanah, udara, hingga dalam tubuhhewan, (Betsy dan Keogh. 2005).
Bakteri umumnya tidak memiliki pigmensehingga tidak berwarna dan hampir tidak
kelihatan karena tidak kontrasdengan medium dimana mereka hidup. Oleh karena
itu, perlu dilakukanpewarnaan agar bakteri tampak jelas bila diamati dengan
mikroskop (Harleydan Presscot, 2002). Pewarnaan dikelompokkan menjadi pewarnaan
langsungdengan pewarnaan basa, pewarnaan tak langsung atau pewarnaan negatif
danpewarnaan gram (Dwidjoseputro, 2003). Pewarnaan basa adalah pewarnaanyang
langsung mewarnai bakteri. Pewarnaan negatif adalah pewarnaan yangtidak
langsung mewarnai bakteri, melainkan mewarnai latar belakang preparatbakteri
tersebut. Pewarnaan ini dilakukan dengan menggunakan pewarna yangbersifat asam
seperti nigrosin atau tinta cina (Harley dan Presscot, 2002).Pewarnaan gram
merupakan pewarnaan umum dalam bidang bakteriologi.Dengan pewarnaan ini,
kelompok bakteri dibedakan menjadi dua yaitu bakterigram positif dan bakteri
gram negatif (Ramona dkk, 2007). Hasil akhir daripewarnaan gram adalah bakteri
gram positif akan berwarna ungu/biru,sementara bakteri gram negatif akan
berwarna merah (Harley dan Presscot,2002).
B. Tujuan
1. Untuk mengetahui morfologi sel bakteri yang
digunakan saatpraktikum.
2. Untuk mengetahui cara membedakan bakteri gram
positif dan gram negatif melalui pewarnaan.
BAB
II
TINJAUAN
PUSTAKA
Pewarnaan garam atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram positif dan gram
negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini
diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuan Denmark Hans Cristian Gram (1853-1938)
yang mengembangkan tehnik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara
pneumokokus dan bakteri klebsiella pneumoniae.
Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna
metil ungu pada metode pewarnaan gram bakteri gram positif akan mempertahankan
warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif
tidak. Pada uji pewarnaan gram, suatu pewarnaan penimbang (counterstain)
ditambahkan setelah metil ungu yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi
berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan
kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
Banyak spesies bakteri gram negatif yang bersifat patogen,yang berarti
mereka berbahaya bagi organisme inang. Sifat potogen ini berkaitan dengan
komponen tertentu pada dinding sel gram negatif, terutama lapisan
lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau Endotoksin).
Tujuan pewarnaan yaitu :
·
Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, ataupu fungi.
·
Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.
·
Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
·
Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang di berikan sehingga sifat-sifat
fisik dan kimia yang ada akan dapat di ketahui.
Pewarnaan
pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :
1. Pewarnaan
sederhana
Pewarnaan
sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut
sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai
organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan
pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka
dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya
bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian
sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana
ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan
sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.
a. Pewarnaan Asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan
hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan
positif adalah metilen biru dan air furksin.
b. Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai
bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan
ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna
untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin
atau tinta cina.
2. Pewarnaan
Diferensial (Gram)
Pewarnaan
Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies
bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif,
berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan
penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan
teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri
Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak
mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram
positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan
alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu
pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat
semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian
ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan
perbedaan struktur dinding sel mereka.
a. Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram
negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada
metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu
gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.
b. Bakteri
Gram Positif
Bakteri gram
positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses
pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah
mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan
klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan
struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)
Bakteri gram
negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida
(lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan
safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel
berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet,
pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding
sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).
Sel bakteri
gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama.
Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu
pendek (Fitria, 2009).
Perbedaan
relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.
Sifat
|
Bakteri
garam (+)
|
Bakteri
gram negatif(-)
|
Komposisi
dinding sel
|
Kandungan
lipid rendah (1-4%)
|
Kandungan
lipid tinggi
|
Ketahanan
terhadap penisilin
|
Lebih
sensitif
|
Lebih
tahan
|
Penghambatan
oleh pewarna basa (VK)
|
Lebih
dihambat
|
Kurang
dihambat
|
Kebutuhan
nutrisi
|
Kebanyakan
spesies relatif kompleks
|
Relatif
sederhana
|
Ketahanaa
terhadap
perlakuan
fisik
|
Lebih
tahan
|
Kurang
tahan
|
(Manurung,
2010).
Pewarnaan
tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh – Neelson dengan pewarna
utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna tandingan metilen blue
Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti dengan penggunaan pembasah yaitu
suatu deterjen untuk mengurangi tegangan permukaan lemak, untuk menjamin
penetrasi. Pewarna yang mengandung pembasah ini disebut pewarna Kinyoun
(Purwoko, 2010).
Sekali
sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat
warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang
bersifat keras seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Alkohol
asam ini merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan
alkohol-aseton yang banyak digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram. Kondisi
pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat warna itu dikatakan tahan asam
dan tampak merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat terlampau
lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan
oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam. Tercucinya karbol
fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh
sel, sehingga bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo, 1993).
Pewarnaan
Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh permukaan
sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak
sampai mendidih atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin
selama 5-7 menit lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang
mengalir perlahan. Setelah itu larutan asam alkohol 3% (hydrochloric
acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci
dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan dibuang. Larutan
methylene blue 0,1% dituang sampai menutup seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit
lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir (Karuniawati, 2005).
4. Pewarnaan
Khusus
Pewarnaan
khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur khusus atau tertentu
dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb. Contoh pewarnaan khusus
:Pewarnaan Endospora Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum,
dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam
siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga
metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan
kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan bahan kimia. Tujuan
dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel
vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat di
bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan
dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit
dibedakan dengan badan inklusi (Aditya, 2010)
a. Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet
panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru
pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul.
Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang yang berwana biru
gelap.
b. Pewarnaan spora
Dinding spora relatif tidak permeable, namun zat
warna bias menembusnya dengan cara memanaskan preparat.
c. Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid
garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada
dinding sel dan flagel.
d. Pewarnaan nucleoid
Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang
khusus untuk DNA (Rudi, 2010).
BAB
III
PELAKSANAAN
PRAKTIKUM
a. Bahan
·
Bakteri
Salmonella sp.
·
Bakteri
Staphylococcus aureus
·
Kristal
violet atau metilen blue
·
Alkohol
·
Safranin
·
Larutan
iodium
b. Alat
Gambar alat
|
Nama alat
|
 |
Mikroskop
|
 |
Ose
|
 |
Pipet
|
 |
bunsen
|
c. Prosedur
kerja
a.
Pengecatan
sederhana
1.
Teteskan
ose suspense yang mengandung bakteri diatas gelas obyek yang bersih
2.
Suspense
ini diratakan sampai tipis, dengan diameter 1 cm
3.
Kemudian
kering anginkan hingga noda yang kering , lakukan fiksasi dengan cara
melewatkan gelas obyek pada nyala api berkali-kali
4.
Tetsilah
kristal violet atau biru metilen. Biarkan selama 1-2 menit, lalu cucilah dengan
air yang mengalir
5.
Kemudian
kering anginkan
6.
Amati
preparat dengan mikroskop pembesaran kuat (dengan minyak immersi) sel-sel
(bakteri akan berwarna biru sedang sporanya berwarna merah).
b.
Pengecatan
gram
1.
Ambillah
1 ose suspense, keringkan diudara, dan fiksasi diatas nyala api
2.
Tetesilah
egnan kristal violet, biarkan 1-2 menit. Cucilah dengan air mengalir kemudian
keringkan diudara
3.
Tetesilah
dengan larutan iodium, biarkan 1-2 menit. Cucilah dengan air mengalir kemudian
keringkan diudara
4.
Cucilah
dengan alkohol (dengan cara meneteskan alkohol pada permukaan noda bakteri)
sampai air cucian tidak berwarna. Cucilah dengan air mengalir kemudian
keringkan diudara
5.
Tetesilah
dengan safranin, biarkan selama 20 detik, cucilah dengan air mengalir lalu
keringkan diudara. Tutup permukaan preparat dengan gelas penutup
6.
Amati
preparat dengan mikroskop perbesaran kuat (dengan minyak ibbersi)
BAB
IV
HASIL
PENGAMATAN
Gambar
pengamatan
|
Keterangan
|
 |
Salmonella
|
 |
Staphylococcus
|
 |
Pewarnaan
sederhana
|
BAB
V
PEMBAHASAN
Praktikum
ini memiliki tujuan agar praktikan terampil dalam melakukan pewarnaan gram
untuk bakteri gram positif dan negatif, mempelajari teknik pewarnaan gram untuk
pengamatan mikroba, mempelajari bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri dari
hasil pengamatan dengan pewarnaan gram, sera membedakan kelompok bakteri
berdasarkan reaksinya terhadap warna dan sekaligus menunjukkan sifat bakteri
tersebut.
Prinsip
dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan
ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna
(Manurung, 2010).
Pewarnaan
Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting
dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau
tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan
lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi
menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki
dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif
mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel
(Manurung, 2010).
Langkah-langkah
utama dalam teknik pewarnaan antara lain:
a. Pembuatan
olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis.
b. Fiksasi,
dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti
sabun, formalin, fenol.
c. Aplikasi
zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna. Pewarnaan gram pada praktikum
ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu:
a. Pemberian
cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
b. Pengintesifan
cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
c. Pencucian
(dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
d. Pemberian
cat lawan yaitu cat warna safranin.
Keempat
tahap tersebut dijelaskan langsung dalam langkah percobaan di bawah ini.
Langkah selanjutnya,
1 tetes kristal violet diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian
didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades
hingga warnanya hilang. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu.
Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna
pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu
berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan
seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu).
Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu
muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah
didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif
mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih
tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan
selama 30 detik bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada
dinding sel bakteri.
Langkah
percobaan yang dilakukan oleh praktikan dimulai dengan 1 tetes sampel yang
berupa bakteri sampel A dan bakteri sampel B diteteskan di atas gelas benda
yang berbeda. Kedua gelas benda berisi sampel tersebut dipanaskan (fiksasi) di
atas bunsen burner. Hal ini bertujuan untuk menguapkan air sehingga hanya akan
didapat bakteri saja. Proses fiksasi juga bertujuan supaya bakteri benar-benar
melekat pada gelas benda sehingga olesan bakteri berupa tetesan sampel tidak
akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses
fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala
api.
Langkah
selanjutnya, 1 tetes iodine diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian
didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades
hingga warnanya hilang. Iodine merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang
berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau
mengintensifkan warna utama. Pemberian iodine pada pengecatan Gram dimaksudkan
untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat iodin terperangkap
antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan
penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan
pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Iodine yang diteteskan
didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi
semakin lebih kuat.
Selanjutnya,
1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan
selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga
warnanya hilang. Etanol 95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk
membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri
(mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi
dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak
akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna
dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat
mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan
tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96%
juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding
sel.
Reaksi yang
terjadi ketika penambahan alkohol 96%
gram + : lipid << +
alkohol 96% pori dinding sel yang terbentuk kecil, protein dinding
sel terdehidrasi, pori tertutup (kompleks kristal violet-iodine
tidak tercuci)gram - : lipid >> +
alkohol 96% pori dinding sel
yang terbentuk besar, protein dinding sel terdehidrasi, pori tidak tertutup (kompleks
kristal violet-iodine tercuci)
Alkohol 96%
yang diteteskan di atas gelas benda didiamkan selama 30 detik kemudia dibilas
dengan aquades dengan tujuan agar warna dapat luntur secara sempurna dan tidak
ada yang tersisa di dalam gelas benda.
Setelah
pembilasan reagen alkohol 96% pada gelas benda sebelumnya, selanjutnya
diteteskan 1 tetes safranin di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan
selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya
hilang. Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini
berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama
setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, safranin memberikan warna
pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna.
Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna
merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding
selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya
rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat
masuk sehingga sel berwarna ungu.
Pemberian
reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain dengan
waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat
berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena
itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama
sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat (efisiensi waktu).
Setiap akhir
pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap gelas benda
dengan menggunakan aquades. pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan
setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada
masing-masing reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan dari aquades
dengan menggunakan kertas tissu agar aquades tidak tercampur dengan reagen atau
pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan terakhir, gelas benda
dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk warna ungu maka
termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna merah atau
merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.
Zat warna
adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam
terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa
kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel
bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai
dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu
asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka
disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat
warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red,
dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4
-, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya
mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel
sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel (Rudi,
2010).
Pewarnaan
bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti fiksasi, peluntur warna,
substrat, intensifikasi pewarnaan, dan penggunaan zat warna penutup. Pada bakteri
gram positif menunjukkan warna biru ungu dan bakteri gram negatif berwarna
merah. Dalam praktikum ini digunakan salah satu pewarnanya yaitu safranin yang
sesuai teori bersifat basa sehingga lebih mudah bersenyawa atau bereaksi dengan
bagian-bagian inti sel bakteri.
Bakteri Gram
negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada
metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil
ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak.
Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan
setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna
merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua
tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (Rudi,
2010).
Pengamatan
bentuk dan ukuran sel bakteri akan tampak jelas jika dilakukan pewarnaan
terhadap sel. Kebanyakan sel-sel bakteri tidak berwarna, sehingga jika di lihat
di bawah mikroskop tidak memperlihatkan warna kontras. Demikian pula
bagian-bagian tertentu misalnya spora, flagella, kapsul atau dinding sel hanya
dapat diamati jika dilakukan pengecatan atau pewarnaan khusus. Dengan pewarnaan
ini, bakteri mula-mula dilapisi dengan larutan zat warna karbol gentinviolet
(karbol kristal violet, karbolmetil violet) dan didiamkan beberapa lama,
kemudian disiram dengan larutan yodium dan dibiarkan terendam dalam waktu yang
sama. Sampai tingkat pewarnaan ini selesai, semua bakteri akan berwarna ungu.
Langkah-langkah
utama dalam mempersiapkan spesimen mikroba yang diwarnai untuk pemeriksaan
mikroskopik ialah :
1. Penempatan olesan atau lapisan tipis spesimen pada
kaca objek.
2. Fiksasi olesan itu pada kaca objek, biasanya dengan
pemanasan, menyebabkan mikroorganisme itu melekat pada kaca objek.
3. Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau
serangkaian larutan pewarna atau reagen (pewarnaan diferensial).
Pewarna yang
digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang akan memberikan
reaksi kalau mengenai bagian tubuh jasad. Karena pewarnaan tersebut berbentuk
ion yang bermuatan positif ataupun negatif.
Sel bakteri
bermuatan mendekati negatif kalau dalam keadaan pH mendekati netral. Sehingga
kalau kita memberikan pewarna yang bermuatan positif, misalnya metilen biru,
hasil pewarnaan akan nampak jelas.
Secara
kimia, zat warna dapat digolongkan kedalam senyawa basa dan senyawa asam. Jika
warna terletak pada muatan positif, maka senyawa tersebut dinamakan zat warna
basa. Sebaliknya jika warna terdapat pada ion bermuatan negatif, maka senyawa
tersebut dinamakan zat warna asam.
Contoh zat
warna basa misalnya : metilen biru, safranin, merah netral dan sebagainya,
dengan anionnya adalah Cl-, SO2-4, CH3OO-, COOHOO-, dsb. Sedangkan zat warna asam misalnya : Na-eosinat
kationnya adalah Na+, K+,
Ca2+, NH3. Disamping zat
warna asam dan zat warna basa, juga didapatkan zat warna indeferen seperti
sudan III, dimetil-amid-azo-benzol, dan zat warna netral seperti eusin-metilen
biru.
Salah satu
sifat dari zat warna untuk menggunakan pewarnaan mikroba ialah bahwa zat warna
asam pada umumnya mempunyai sifat bersenyawa lebih cepat dengan bagian-bagin
sitoplasma sel, sedang zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti
sel.
Faktor –
faktor penentu keberhasilan dalam pewarnaan mikroba ialah :
·
Fiksasi
Fiksasi
dilakukan sebelum zat warna digunakan, bertujuan untuk :
v
Melekatkan sel pada gelas objek.
v
Membunuh mikroba, karena sel dalam keadaan mati lebih mudah diwarnai daripada
sel dalam keadaan hidup.
v
Melepaskan granular protein menjadi gugus reaktif-NH3 yang akan bereaksi dengan gugus OH- dari zat warna.
v
Mencegah terjadinya otolitis sel, yaitu proses pecahnya sel yang disebabkan
oleh enzim yang ada didalamnya.
v
Merubah daya ikat zat warna.
Fiksasi
dapat dilakukan secara fisik dengan pemanasan ataupun pengeringan secara
dingin, sedangkan yang paling umum dilakukan secara kimia dengan penambahan
sabun, formalin, fenol, dan sebagainya.
·
Pelunturan
warna
Pelunturan
warna bermaksud untuk menghilangkan warna sel yang telah diwarnai. Senyawa ini
digunakan untuk menghasilkan keadaan yang kontras pada sel mikroba sehingga
dengan jelas dapat dilihat dibawah mikroskop misalnya.
Pada umumnya
sel mikroba yang mudah diwarnai akan lebih cepat pula dilunturkan, sedangkan sebaliknya
sel mikroba yang sukar diwarnai akan sulit pula untuk dilunturkan. Sifat cepat
dan lambatnya cara pelunturan inilah yang diperbedakan untuk membedakan
kelompok mikroba setelah diberi pewarnaan.
Dari segi
ketahanan sel terhadap senyawa kimia, dibidang mikrobiologi dikeSnal ada tahan
asam, tahan alkohol, tahan air dan sebagainya. Ketahanan terhadap suatu zat
kimia inipun dipergunakan untuk membedakan kelompok mikroba.
BAB
VI
JAWAB
PERTANYAAN
1.
Buat tabel yan berisi berisi urutan
pewarna gram serta reaksi yang terjadi dan warna yang terbentuk
Zat warna dan urutan pewarnaan
|
Reaksi bakteri
|
|
Gram positif
|
Gram negatif
|
|
Kristal violet / carbol gentian
violet
|
Sel berwarna ungu
|
Sel berwarna ungu
|
Lugol
|
Komplek KV-L terbentuk dalam sel,
sel tetap berwarna ungu
|
Komplek KV-L terbentuk dalam sel,
sel tetap berwarna ungu
|
Alkohol 70/96%
|
Dinding sel dehidrasi, pori-pori
mengecil, daya serap dinding sel dan membran KV-L tidak keluar sehingga sel
tetap berwarna ungu
|
Lipid terekstraksi dari dinding sel,
pori-pori mengembang, komplek KV-L keluar dari sel sehingga sel tidak
berwarna
|
Safranin
|
Sel tidak berpengaruh sehingga sel
tetap berwarna ungu
|
Sel menyerap zat pewarna sehingga
berwarna merah
|
2.
Buatkan gambar sel bakteri (dan
sporanya) dan beri keterangan (warna, bentuk dan ciri-ciri lain)
Staphylococcus aureus
merupakan bakteri Gram Positif, tidak
bergerak,tidak berspora dan mampu membentuk kapsul. (Boyd,
1980), berbentuk kokusdan tersusun seperti buah anggur (Todar, 2002)
sebagaimana terlihat padagambar 2.4. Ukuran Staphylococcus berbeda-beda
tergantung pada mediapertumbuhannya. Apabila ditumbuhkan pada media agar,
Staphylococcusmemiliki diameter 0,5-1,0 mm dengan koloni
berwarna kuning. Dinding selnyamengandung asam teikoat, yaitu sekitar 40% dari
berat kering dinding selnya.Asam teikoat adalah beberapa kelompok antigen dari
Staphylococcus. Asamteikoat mengandung aglutinogen dan N-asetilglukosamin.
(Boyd, 1980).
Salmonella
berbentuk batang, tidak berspora dan tidak bersimpai tetapimempunyai flagel
feritrik (fimbrae), pada pewarnaan gram bersifat gram negatif, ukuran 2- 4
mikrometer x 0,5- 0,8 mikrometer dan bergerak. Padabiakan agar koloninya besar,
bergaris tengah 2- 3 milimeter, bulat, agak cembung, jernih, lucin, dan tidak
menyebabkan hemolisis (Gupte, 1990)
3.
Berdasarkan ciri-cirinya,
klasifikasikan jenis bakteri yang saudara amati
Staphylococcus:
1. Berbentuk bulat dengan diameter
kira-kira 0,5-1,5 𝜇m.
2. Sel-selnya bersifat gram positif, dan
tidak aktif melakukan gerakan (non motile)
3. Bersifat patogen dan menyebabkan lesi
lokal yang oportunistik
4. Bersifat anaerob fakultatif
5.
Menghasilkan
katalase
6.
Sebagian
besar adalah saprofit yang hidup dialam bebas, namun habitat alamiahnyaadalah
pada permukaan epitel golongan primate / mamalia
7.
Bersifat β-hemolitik
8.
Toleran garam (halodurik)
9.
Meiliki protein A pada permukaannnya yang mengikat Fclg
(menghambat fagositosis)
10.
Menghasilkan pigmen kuning dan mungkin memproduksi
eksotoksin.
Salmonella:
Salmonella sp. adalah
bakteri batang lurus, gram negatif, tidakberspora, bergerak dengan flagel
peritrik, berukuran 2-4 μm x 0.5-0,8
μm. Salmonella
sp. tumbuh cepat dalam
media yang sederhana (Jawet’z,dkk, 2005), hampir tidak pernah memfermentasi
laktosa dan sukrosa,membentuk asam dan kadang gas dari glukosa dan manosa,
biasanyamemporoduksi hidrogen sulfide atau H2S, pada biakan agar koloninyabesar
bergaris tengah 2-8milimeter, bulat agak cembung, jernih, smooth,pada media BAP
tidak menyebabkan hemolisis, pada media Mac Concey koloni Salmonella sp. Tidak
memfermentasi laktosa (NLF),konsistensinya smooth (WHO, 2003) Salmonella sp.
tahan hidup dalam air yang dibekukan dalamwaktu yang lama, bakteri
ini resisten terhadap bahan kimia tertentu.
11.
BAB
VII
KESIMPULAN
Percobaan kali ini didapatkan kesimpulan sebgai berikut:
1. Bakteri dapat dibedakan melalui teknik
pewarnaan gram. Teknik pewarnaantersebut dapat menghasilkan warna merah dan
ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan merah, sedangkan yang
positif berwarna ungu.
2. Salmonella sp dari isolate ikan mentah
termasuk bakteri gram negative,karena hasil pengamtan secara mikroskopis
berwarna merah.
3. Sel-sel bakteri secara khas berbentuk
kokus, basil, dan spiral. Kokus adalahbakteri yang serupa bola- bola kecil.
Kokus yang bergandeng dua disebut diplokokus, yang mengelompok berempat disebut
tetrakokus. Basil adalah bakteri panjang
berbentuk batang, yang bergandengan panjang disebut streptobasil dan
yang bergandeng dua disebut diplobasil. Spiral adalah baktreri yang bengkok yang menyerupai spiral
DAFTAR
PUSTAKA
bagus aku copas
BalasHapus